ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی

ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی با SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE با استفاده از پلاسمای هیدروژن پروکسید: تأثیرگذاری روی استفاده‌ی مجدد از تجهیزات یک‌بارمصرف

مقدمه: یکی از پیامدهای جدی همه‌گیری SARS-CoV-2، کمبود تجهیزات حفاظتی برای کارکنان بخش بهداشت است. ماسک‌های N95 به‌عنوان یکی از تجهیزات ضروری حفاظتی در مدیریت بیماران مبتلا به کووید-19 در نظر گرفته‌شده است. کمبود ماسک‌های N95، خطرات بالقوه‌ی بهداشتی برای کارکنان بخش سلامت و زیان‌های قابل توجه اقتصادی برای مؤسسات بهداشتی به همراه دارد. هدف از این کار، بررسی ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی با SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE با استفاده از پلاسمای هیدروژن پروکسید بوده است.

مواد و روش‌ها:  ما از طریق انجام یک مطالعه در خصوص آلودگی مصنوعیِ در محلِ ماسک‌های N95، ظرفیت ضدعفونی‌کننده‌ی پلاسمای هیدروژن پروکسید در برابر SARS-CoV-2 و دو عضو از باکتری‌های ESKAPE (اسینتوباکتر بومانی[1] و استافیلوکوک آیریوس[2]) را موردبررسی قرار داده‌ایم. تقویت ژن‌های خاص با RT-PCR ویروس SARS-CoV-2 و کشت میکروبیولوژیکی باکتری‌های ESKAPE، قبل و بعد از فرآیند ضدعفونی انجام‌شده است.

نتایج: پس از آزمایش‌های ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 با پلاسمای هیدروژن پروکسید، SARS-CoV-2 در هیچ کدام از محک‌ها با استفاده از 5 غلظت مختلف از این ویروس مشاهده نشد؛ همچنین باکتری‌های ای. بومانی و اس. آیریوس در مایه‌های 10² تا 10⁶ CFU هم قابل‌کشت نبودند.

نتیجه‌گیری. ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 با استفاده از فناوری پلاسمای هیدروژن پروکسید می‌تواند گزینه‌ای برای استفاده‌ی مجدد از آن‌ها در شرایط کمبود این تجهیزات باشد. پیامدهای استفاده از فناوری‌های ضدعفونی‌کننده‌ی ماسک‌های N95 و ایمنی کارکنان بهداشتی موردبحث قرارگرفته است.

مقدمه:

یکی از مشکلات اصلی در سراسر جهان، تأمین ناکافی ماسک‌های N95 برای مراقبت از افراد در واحدهای بیمارستانی است؛ برای مثال، ایالات‌متحده تخمین زده است که به 5/3 میلیارد ماسک N95 برای کارکنان سلامت در حین این همه‌گیری نیاز خواهد داشت و طبق برآوردهای جاری، این کشور تنها دارای یک درصد از این مقدار لازم است. کمبود تجهیزات حفاظتی برای مدیریت بیماران مبتلا به کووید-19 ناشی از همه‌گیری SARS-CoV-2، منجر به ایجاد این نیاز برای پیاده‌سازی گزینه‌هایی شده است که امکان استفاده‌ی مجدد از آن را فراهم می‌کنند. مجرای تنفسی که مسیر اصلی ورود SARS-CoV-2 است، به‌عنوان یکی از حیاتی‌ترین نقاطی در نظر گرفته می‌شود که به حفاظت نیاز دارد. به‌منظور جلوگیری از آلوده شدن کارکنان سلامت، ماسک‌های N95 به دلیل سطح بالای حفاظتی آن‌ها برای مدیریت بیماران مشکوک و تأییدشده‌ی SARS-CoV-2 ضروری هستند؛ این ماسک‌ها از انتشار ویروس از طریق بیوآیروسل‌های ایجادشده توسط بازدم بیماران جلوگیری می‌کنند. بنابراین کمبود آن‌ها، خطرات بالقوه‌ی سرایت ویروس بین کارکنان سلامت و بیماران را افزایش می‌دهد. در ایالات‌متحده، تعداد هشداردهنده‌ای از کارکنان حوزه‌ی سلامت به ویروس SARS-CoV-2 آلوده‌شده و بیش از 100 پزشک و پرستار هم در سرتاسر جهان جان خود را از دست داده‌اند. این امر نشان‌دهنده‌ی اهمیت تأمین ایمنی و فراهم کردن تجهیزات حفاظتی کافی برای کارکنان بهداشت است. حفاظت از مجرای تنفسی کارکنان حوزه‌ی بهداشت یک امر چالش‌برانگیز است؛ بنابراین تأمین ایمنی کارکنان بهداشت از طریق استفاده از ماسک‌های N95 در حین مدیریت بیماران کووید-19 امری حیاتی است. اثربخشی ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 با استفاده از روش‌های مختلف از جمله استفاده از نور فرابنفش و بخار هیدروژن پراکسید، در مطالعات قبلی موردبررسی قرارگرفته است. علاوه بر این و از منظر میکروبیولوژیکی، باکتری‌های ESKAPE (انتروکوکوس فاسیوم[3]، استافیلوکوک آیریوس، کلبسیلا پنومونیه[4]، اسینتوباکتر بومانی، سودوموناس اروژینوزا[5] و انتروباکتر کلواکه[6]) ایجادکننده‌ی ذات‌الریه‌ی مرتبط با ونتیلاتور[7] (VAP) بوده و خطر بالقوه‌ای برای کارکنان بهداشت هستند؛ به خاطر اینکه واحد مراقبت‌های ویژه، اصلی‌ترین بخش بیمارستانی محسوب می‌شود که دارای این نوع از باکتری‌ها است. در مطالعه‌ی قبلی که توسط گروه ما انجام‌گرفته، گزارش‌شده است که دو عضو از گروه ESLAPE (اسینتوباکتر بومانی و استافیلوکوک آیریوس) اصلی‌ترین عوامل ایجادکننده‌ی VAP در بیمارستان «Juárez de México» (HJM) هستند. بنابراین، مطالعه‌ی اثر ضدعفونی‌کنندگی روی این نوع از باکتری‌ها هم اطلاعات ارزشمندی از ایمنی میکروبیولوژیکی برای کارکنان بهداشتی فراهم می‌کند.

هدف از این کار، بررسی ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی با SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE با استفاده از پلاسمای هیدروژن پروکسید بوده است. پیامدهای استفاده از فناوری‌های ضدعفونی‌کننده‌ی ماسک‌های N95 و ایمنی کارکنان بهداشتی موردبحث قرارگرفته است.

مواد و روش‌ها:

SARS-CoV-2، سویه‌های باکتریایی و شرایط رشد

SARS-CoV-2 و سویه‌های باکتریایی تحت کابین ایمنی زیستی سطح 2[8] و طبق ایمنی زیستی آزمایشگاهی موردبررسی قرارگرفته‌اند؛ اپراتورها هم گان تماماً محافظ پوشیده‌اند. قبل از آزمایش آلودگی مصنوعی ماسک‌های N95 با SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE، مشخصات ژنتیکی گونه‌های بالینی SARS-CoV-2 به شرح زیر تعیین‌شده است. نمونه‌های خلط دهان و ترشحات حلق و بینی به‌دست‌آمده از بیماران علامت‌دار بستری در بخش ICU بیمارستان Juárez de México در محلول نگهداری ویروس (شرکت Biocomma، DOUBANGTM یک‌بارمصرف) جمع‌آوری شده‌اند؛ سپس از این نمونه‌ها برای تشخیص SARS-CoV-2 با استفاده از واکنش زنجیره‌ی پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR) زمان‌حقیقی[9]، مطابق با پروتکل برلین[10] استفاده‌شده است. به طور خلاصه، RNA با استفاده از یک مینی کیت RNA ویروسی QIAamp (شرکت QIAGEN، هیلدن، آلمان)، طبق دستورالعمل‌های شرکت سازنده استخراج و خالص‌سازی شده است. یک تقویت مالتی‌پلکسی (ژن‌های E، RdRp و RNAse P) با استفاده از کیت WoV19 (شرکت Genes2Life، ایراپاتو گواناخواتو، مکزیک) به‌منظور تائید وجود SARS-CoV-2 انجام‌شده است. نمونه‌ی شناسایی‌شده به‌عنوان SARS-CoV-2 برای آزمایش‌های بعدی در دمای 8 درجه‌ی سلسیوس نگهداری شده است. در تمامی آزمایش‌های RT-PCR، کنترل‌های مثبت فراهم‌شده توسط موسسه‌ی «de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos» (InDRE-مکزیک) برای ژن‌های E، RdRp و RNAse P) مورداستفاده قرارگرفته‌اند. سویه‌های باکتریایی مورداستفاده در این مطالعه، بخشی از مجموعه پاتوژن‌های میکروبی واحد تحقیقاتی HJM هستند. سویه‌ها قبلاً از بیماران بستری در بخش ICU بیمارستان HJM ایزوله شده و به لحاظ ژنتیکی با تحلیل توالی ژن 16S rRNA شناسایی‌شده‌اند (جدول 1).

آماده‌سازی SARS-CoV-2

رقیق‌سازی‌های زنجیره‌ای (1:10، 1:100، 1:1000 و 1:10000) ویروس SARS-CoV-2 در مدیوم‌های حفاظت ویروسی انجام‌شده‌اند. نمونه‌ی بالینی رقیق نشده‌ی حاوی SARS-CoV-2 هم در مطالعه گنجانده‌شده است. در تمامی این رقیق‌سازی‌ها، وجود SARS-CoV-2 با استفاده از آزمایش‌های RT-PCR فوق‌الذکر تائید شده است.

تهیه‌ی سوسپانسیون‌های باکتریایی ESKAPE

اسینتوباکتر بومانی و اس. آیریوس روی محیط کشت LB-agar رگه زایی[11] شده و در کل شب در دمای 37 درجه‌ی سلسیوس انکوبه شده‌اند. سویه‌ها تحت چرخش 200 دور در دقیقه در دمای 37 درجه‌ی سلسیوس برای 24 ساعت در محیط کشت LB-broth تلقیح شده‌اند. محیط‌های کشت با استفاده از یک طیف‌نورسنج مدل SmartSpec™ flow (BIORAD) در 600 نانومتر به 10⁶ CFU/50μl تنظیم‌شده و به غلظت‌های 10²، 10³، 10⁴ و 10⁵CFU/50μl  رقیق‌سازی شده‌اند. به‌منظور تائید غلظت باکتریایی، محیط‌های کشت روی LB-agar قرارگرفته و برای شمارش CFU/ml (در سه نسخه) انکوبه شده‌اند. سوسپانسیون‌های باکتریایی قبل از استفاده، روی یک بستر یخ نگهداری شده‌اند.

آلودگی مصنوعی ماسک‌های N95 با SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE و ضدعفونی کردن با پلاسمای هیدروژن پروکسید

تمامی آزمایش‌های آلودگی تحت شرایط ضدعفونی در یک اتاقک با جریان آرام[12] انجام شده‌اند. 10 ماسک N95 3M^® (مدل 8210) به دو گروه A (مسئله) و B (کنترل) تقسیم‌بندی شده‌اند. مطابق با شکل 1، 50 میکرولیتر از هر محلول رقیق‌شده‌ی SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE به یک سطح 1 سانتیمتر مربعی در سطح خارجی ماسک‌های N95 تلقیح شده‌اند. در ادامه این مایه‌ها، برای جذب کامل در مواد ماسک N95، به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شده‌اند. با گذشت زمان، ماسک‌های N95 «گروه A» (مسئله) به طور تکی در کیسه‌های استریلیزه کننده‌ی “Tyvek^®” (با نشانگر شیمیایی STERRAD^® و نشانگر زیستی STERRAD VELOCITY^TM) قرار داده‌شده و این کیسه‌ها کاملاً مهروموم شدند؛ سپس مواد مذکور به گونه‌ای که در ادامه نشان داده‌شده، با استفاده از پلاسمای هیدروژن پراکسید تحت ضدعفونی شدن قرار گرفته‌اند. آزمایش‌های ضدعفونی کردن، در یک دستگاه استریل کننده‌ی STERRAD^® 100NX^® (شرکت ASPTM، ایالات‌متحده) با استفاده از چرخه‌ی استریل کننده‌ی « STERRAD^® NXاستاندارد» با قرار گرفتن در معرض پلاسمای پروکسید هیدروژن به مدت 47 دقیقه، بر طبق پروتکل‌های شرکت سازنده انجام گرفته‌اند. ماسک‌های N95 گروه B (کنترل) طبق توضیحات زیر، به ترتیب با استفاده از RT-PCR و محیط کشت باکتریایی، در معرض ریکاوری SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE قرار گرفته‌اند.

آشکارسازی SARS-CoV-2 و باکتری‌های زنده مانده‌ی ESKAPE پس از ضدعفونی با پلاسمای هیدروژن پراکسید

پس از ضدعفونی ماسک‌های N95، نواحی تلقیح این ماسک‌ها با SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE برش داده‌شده است. ویروس کرونا و باکتری‌های ESKAPE، به طور جداگانه و به ترتیب در مدیوم حفظ ویروس و محلول سالین از ماسک‌های N95 شسته شده‌اند. پنج مورد اول در معرض استخراج RNA و تقویت ویژه‌ی ژن‌های E، RdRp و RNAse P قرار گرفته و پنج مورد دیگر هم به طور مناسبی رقیق‌سازی شده و شمارش تعداد زنده‌ی این میکروارگانیسم‌ها با قرار دادن آن‌ها در LB-agar انجام‌شده است. پس از انکوباسیون، کلونی‌ها (فقط درصورتی‌که رشدی وجود داشت) مورد شمارش قرار گرفته و به‌صورت CFU گزارش شده‌اند؛ سپس مقدار متوسط CFU، قبل و بعد از فرآیند ضدعفونی با هم مقایسه شده‌اند. درصد مرگ باکتری‌ها پس از فرآیند ضدعفونی، در غلظت‌های مختلف باکتری‌ها محاسبه‌شده است. هر آزمایش سه مرتبه انجام‌شده است.

نتایج

پلاسمای هیدروژن پراکسید، از تشخیص SARS-CoV-2 با آزمایش RT-PCR در ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی، جلوگیری می‌کند.

به‌منظور بررسی فعالیت ضدعفونی‌کننده‌ی پلاسمای هیدروژن پراکسید، پنج رقیق‌سازی مختلف از SARS-CoV-2 (از جمله نمونه‌های بالینی رقیق نشده) بر روی ماسک‌های 95 به‌منظور شبیه‌سازی آلودگی واقعی ماسک‌های N95 در کارکنان سلامت تلقیح شده است (شکل 1). تمامی رقیق‌سازی‌های SARS-CoV-2 پس از تلقیح در ماسک‌های N95 با استفاده از آزمایش RT-PCR آشکارسازی شده‌اند؛ بنابراین عدم‌تشخیص SARS-CoV-2 ناشی از ضدعفونی پلاسمای هیدروژن پروکسید بوده است. ما دریافتیم که پلاسمای هیدروژن پروکسید به‌محض اعمال به ماسک‌ها در تمامی غلظت‌های ویروسی، از آشکارسازی SARS-CoV-2 با استفاده از آزمایش RT-PCR (در مقایسه با موارد کنترل) جلوگیری می‌کند (جدول 2).

پلاسمای هیدروژن پراکسید، باکتری‌های ESKAPE در ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی را از بین می‌برد.

سویه‌های اسینتوباکتر بومانی و اس. آیریوس در پنج غلظت باکتریایی تست‌شده، پس از درمان با پلاسمای هیدروژن پراکسید به طور کامل در ماسک‌های N95 از بین رفته‌اند. محاسبات مربوط به زیست پذیری باکتری‌ها قبل و بعد از پاک‌سازی، نشان‌دهنده‌ی مرگ 100 درصدی باکتری‌ها است. این مشاهدات با عدم رشد باکتری‌ها در تمامی محک‌های ریکاوری باکتریایی با کشت باکتری‌ها روی صفحات TSA تائید شده است (جدول2).

بحث

طبق توصیه‌های مربوط به تجهیزات حفاظت شخصی[13] (PPE) اجباری برای مراقبت از بیماران مشکوک یا قطعی SARS-CoV-2، این تجهیزات باید شامل دستکش، گان، عینک‌های محافظ و ماسک‌های صورت باشد. بااین‌حال، ماسک‌های N95 با فراهم کردن یک مهروموم کامل روی پوست محافظت بیشتری از ماسک‌های جراحی ایجاد می‌کنند. با توجه به توصیه‌ها و پروتکل‌ها در رابطه با پیشگیری و کنترل عفونت، این نوع از ماسک‌ها پس از استفاده باید دور ریخته شوند؛ به خاطر اینکه به‌عنوان تجهیزات شخصی یک‌بارمصرف در نظر گرفته می‌شوند. اگرچه که تجهیزات حفاظتی کارکنان سلامت به‌عنوان تجهیزات یک‌بارمصرف در نظر گرفته می‌شوند، اما در شرایط اضطراری مانند همه‌گیری فعلی بیماری کووید-19، ضروری است که استراتژی‌هایی برای استفاده‌ی مجدد از تجهیزات حفاظت ضروری مانند ماسک‌های N95، اتخاذ شود. ضدعفونی کردن ماسک‌های یک‌بارمصرف N95 و متعاقباً استفاده‌ی مجدد از آن‌ها، تنها باید به‌عنوان یک استراتژی در شرایط بحرانی به کار گرفته شود. با توجه به موارد فوق‌الذکر، این مطالعه به‌منظور نشان دادن این امر انجام‌شده است که شرایط آزمایشگاهی آلودگی مصنوعی ماسک‌های N95 و استفاده‌ی بعدی از پلاسمای هیدروژن پراکسید، اثرات ضدعفونی‌کنندگی در مقابل ویروس SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE (اسینتوباکتر بومانی و اس. آیریوس) داشته است. آزمایش‌های تشخیصی با RT-PCR (در مقایسه با نمونه‌های کنترل) پس از درمان با پلاسمای هیدروژن پراکسید نشان داد که ژن‌های مورداستفاده برای تشخیص SARS-CoV-2 را نمی‌توان تقویت کرد؛ حتی با این شرایط که دقت روش مورداستفاده‌ی ما در آزمایشگاه، 100 کپی از SARS-CoV-2 بود.

با توجه به این نتایج به این فرضیه می‌رسیم که به خاطر مکانیسم عمل پلاسمای هیدروژن پراکسید، مواد ژنتیکی ویروس SARS-CoV-2 به طور قابل توجهی آسیب می‌بینند؛ به خاطر اینکه دیگر نمی‌توان آن‌ها را با RT-PCR تشخیص داد. این امر شناخته‌شده‌ای است که پلاسمای گازی هیدروژن پراکسید تولیدشده در یک اتاقک دربسته‌ی تحت خلأ، می‌تواند ذرات بارداری تولید کند که بسیاری از آن‌ها رادیکال‌های آزاد بسیار فعال هستند. این رادیکال‌ها به خاطر برهم‌کنش خود با مؤلفه‌های اصلی باکتری‌ها، قارچ‌ها و ویروس‌ها، از جمله آنزیم‌های ضروری و نوکلئیک اسیدها (DNA و RNA)، توانایی ضدعفونی کردن مواد و بنابراین جلوگیری از ظرفیت تکثیر و عفونی شدن آن‌ها را دارند. استراتژی انجام آزمایش‌های آلودگی مصنوعی با نمونه‌ای از منشأ بالینی SARS-CoV-2 و نه با کشت ویروسی، امری کاملاً موجه است. هدف از انجام این آزمایش‌ها، دستیابی به شرایطِ تا حد امکان واقعی آلودگی به وسیله‌ی بیوآیروسل‌ها است. مشخص‌شده است که کارکنان بهداشتی در طی بازدم بیماران مبتلا به کووید-19 در معرض آلودگی SARS-CoV-2 قرار می‌گیرند. بیوآیروسل‌های تولیدشده توسط افراد آلوده، به‌عنوان دلیل اصلی عفونت SARS-CoV-2 شناخته‌شده‌اند؛ ذرات بزاق قابل تنفس با اندازه‌های 1 تا 10 میکرومتر بیشترین اهمیت را در این زمینه دارند. در مقابل، عفونت‌های مشترک گزارش‌شده به خاطر باکتری‌های ESKAPE ایجادکننده‌ی VAP در بیماران مبتلا به کووید-19 در بخش‌های دیگر دنیا، عامل مهمی هستند که می‌توانند منجر به افزایش ابتلا به عفونت‌های باکتریایی شوند؛ در این مورد، کادر درمانی هم می‌توانند تحت تأثیر قرار بگیرند. سویه‌های باکتریایی مورداستفاده در این مطالعه، مشخصه‌های ژنتیکی‌ای (فاکتورهای مقاومت ضد میکروبی و واگیری) دارند که به آن‌ها اجازه می‌دهد لایه‌های زیستی[14] بالغی را روی سطوح خنثی، از جمله ماسک‌های N95 تشکیل دهند (جدول 1). از بین رفتن کامل سویه‌های بررسی‌شده در این مطالعه، شواهد ذکرشده در رابطه با آسیب مستقیم پلاسمای هیدروژن پراکسید در ماکرو مولکول‌های حیاتی برای تکثیر عوامل بیماری‌زا را تقویت می‌کند. با توجه به شواهد مطرح‌شده در این کار، اعتقاد ما بر این است که استفاده از پلاسمای هیدروژن پراکسید تحت شرایط استاندارد ضدعفونی ماسک‌های N95، می‌تواند گزینه‌ای برای ضدعفونی و احتمالاً جایگزینی برای سایر وسایل حفاظتی در شرایط کمبود تجهیزات باشد.

علاوه بر این، ما در حوزه‌ی انجام تحقیقات در زمینه‌ی ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 استفاده‌شده، با به‌کارگیری روش‌هایی که مشخصات فیزیکی حفاظتی ماسک‌ها را حفظ کرده و از تخریب مواد سازنده‌ی آن‌ها جلوگیری می‌کند هم مشارکت داریم.

نتیجه‌گیری: پلاسمای هیدروژن پراکسید را می‌توان به خاطر فعال بودن آن، به‌عنوان گزینه‌ای برای ضدعفونی کردن ماسک‌های N95 در نظر گرفت.

شکل 1- استراتژی عمومی برای آلودگی مصنوعی ماسک‌های N95 با ویروس SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE (اسینتوباکتر بومانی و استافیلوکوک آیریوس) برای ضدعفونی کردن متعاقب با استفاده از پلاسمای هیدروژن پراکسید. A) طرح نقاط تلقیح، B) آلودگی مصنوعی و جذب تلقیح‌ها، C) بسته‌بندی ماسک، D) ضدعفونی کردن با پلاسمای هیدروژن پراکسید و E) آشکارسازی SARS-CoV-2 و کشت باکتری‌های ESKAPE قبل و بعد از قرار دادن در معرض پلاسمای هیدروژن پراکسید.

شکل 2- منحنی‌های تقویت با RT-PCR مربوط به SARS-CoV-2 در ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی. A) موارد کنترلی بدون انجام ضدعفونی با پلاسمای هیدروژن پراکسید و B) موارد آزمایشی با انجام ضدعفونی با پلاسمای هیدروژن پراکسید.

جدول 1- سویه‌های باکتریایی و ویروسی مورداستفاده در این مطالعه

جدول 2- نتایج آشکارسازی گونه‌ی SARS-CoV-2 و باکتری‌های ESKAPE (اسینتوباکتر بومانی و استافیلوکوک آیریوس) قبل و بعد از ضدعفونی ماسک‌های N95 آلوده‌شده به‌صورت مصنوعی.

* با روش RT-PCR

** روش صفحه گذاری روی TSA-agar

[1] Acinetobacter baumannii

[2] Staphylococcus aureus

[3] Enterococcus faecium

[4] Klebsiella pneumoniae

[5] Pseudomonas aeruginosa

[6] Enterobacter cloacae

[7] Ventilator-Associated Pneumonia

[8] Biosafety level 2 cabinet

[9] Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

[10] Berlin protocol

[11] Streak

[12] Laminar flow cabinet

[13] Personal Protective Equipment

[14] Biofilms